Rosetta(DE3)pLysS Chemically Competent Cell

大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

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菌株描述

Rosetta宿主菌是BL21衍生菌，特別設(shè)計(jì)用于提高含大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達(dá)水平，這些菌株補(bǔ)充6種大腸桿菌缺乏的稀有密碼子（AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA）對(duì)應(yīng)的tRNA，位于兼容的氯霉su抗性質(zhì)粒上，正因如此，Rosetta菌株提供“通用型"的翻譯特征，而不限于大腸桿菌可利用的密碼子。

tRNA基因由天然啟動(dòng)子所啟動(dòng)。DE3命名表明該菌株染色體上整合λ噬菌體DE3溶原體（攜帶lacUV5啟動(dòng)子調(diào)控的T7 RNA聚合酶基因）。這種菌株適用于目的基因克隆在pET載體上的蛋白生產(chǎn)，由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。pLysS菌株表達(dá)T7溶菌mei，其在誘導(dǎo)前進(jìn)一步抑制T7 RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)，從而穩(wěn)定編碼影響細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的靶蛋白的pET重組體。

Rosetta(DE3)pLysS菌株基因型：F-ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysSRARE (CamR)

產(chǎn)品描述

本品是大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS菌株經(jīng)特殊工藝制作所得的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的熱擊轉(zhuǎn)化。經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高于107 cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

產(chǎn)品包裝

保存與運(yùn)輸條件：

保存：-80℃保存，六個(gè)月有效。

運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 感受態(tài)細(xì)胞必須用干冰運(yùn)輸，感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)在-80℃保存。

2） 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化，不可在冰上放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3） 進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，需在相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件下進(jìn)行。

4） 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可保留部分連接反應(yīng)液以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到zuidi。

5） 產(chǎn)品包裝內(nèi)含質(zhì)粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供對(duì)照實(shí)驗(yàn)用。

6） 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

7） 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度范圍可選：0.1~2mM。

8） 為了得到足量的蛋白，需就最佳誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化。

9） Rosetta(DE3)pLysS菌株攜帶pLysSRARE質(zhì)粒，除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無(wú)抗生素外，其余所用培養(yǎng)基，培養(yǎng)液均要加入34µg/ml氯霉su，以防質(zhì)粒丟失。

10） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行】

1） 從-80℃冰箱取出取感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物），用手輕彈管底輕輕混勻（避免用槍吸打），冰浴靜置25min。

2） 42℃水浴熱激45s，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2min。此過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。

3） 向每個(gè)離心管中加700 μl無(wú)菌的LB或2YT培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃搖床，200 rpm振蕩培養(yǎng)60min，目的使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

4） 低速離心收菌（比如5000rpm，1min），留取100μl左右上清，用槍輕輕吹打重懸菌塊，之后加到含34µg/ml氯霉su和所選質(zhì)粒篩選抗生素的LB或2YT固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開(kāi)，將平板置于室溫（或37℃）直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

【注意】：

a）涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。若轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可不用離心，直接取少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，若轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，則通過(guò)離心（5000 rpm，1min）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。

b）新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少，可以將剩下的菌液再涂布新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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