PKmito DEEP RED (PKMDR)  活細胞線粒體熒光探針

產品信息

產品描述

PKmito DEEP RED (PKMDR)是北京大學陳知行課題組研發的PKmitoTM系列染料中的成員之一，兼具明亮的熒光、非常低的化學毒性和光學毒性，以及優秀的線粒體定位能力的特征[1]。

PKmito DEEP RED (PKMDR)高特異性標記活細胞的線粒體。由于胞內分子三線態淬滅劑COT基團的存在，賦予該探針極其低的光學毒性，從而使其適合用于線粒體的長時間示蹤。PKMDR-FLIM是一種非常有效的工具以高時空分辨率直接成像觀察線粒體膜電位（Δψm）[2]。PKMDR的最大吸收和發射波長分別是：644nm和670m，能用標準的Cy5濾片成像，也能用于寬場、共聚焦、SIM或FLIM顯微鏡。

PKmito DEEP RED (PKMDR)的重要特征：

j Ab：644nm；Em：670m；

k 適用于活細胞線粒體的長期成像；

l 不適合用于固定細胞的線粒體染色；

m 兼容于寬場、共聚焦、SIM或FLIM顯微鏡。

產品特性

保存與運輸方法

保存：≤-20°C避光干燥保存，收到貨至少12個月有效。 

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 本品量非常少，使用前低速離心后直接加適當溶劑溶解使用，切勿分裝稱量。

2） 整個染色過程中需注意避光。

3） PKmito DEEP RED (PKMDR)雖有報道用于STED超分辨顯微技術，但成功率比較低。若需深紅色激發通道的線粒體熒光探針，且需做STED，推薦使用HBmito Crimson（MX4329-5nmol）。

4） PKmitoTM產品的商標持有者是Genvivo Biotech Co., Ltd.

5） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 儲存液的配制

j 初次使用，請將低溫保存的PKMDR（固體）置于室溫回溫至少20min，低速離心3~5min。

k 于超凈臺內開蓋，直接往管內加入適量高質量的無水DMSO使其溶解，配制成250µM（1000×）母液。本染料可以反復凍融，因此，不建議分裝。每次使用完畢后，請將1000×母液置于≤-20°C 以下避光凍存。但務必要注意，每次開蓋取樣前，不管是固體還是母液，都必須讓其恢復到室溫。在正確的溶解和儲存和使用習慣下，母液至少能穩定保存3個月。

a）MX4328-5nmol：往管內加入20µl無水DMSO，使其溶解且充分混勻，得到250µM（1000×）母液；

b）MX4328-25nmol：往管內加入100µl無水DMSO，使其溶解且充分混勻，得到250µM（1000×）母液；

l 如需長期保存，可在產品初次開封后，用DMF或任意比例的乙腈水溶液溶解產品后分裝，真空干燥、凍干或氮氣吹干后，即可長期保存（至少一年）。

2. 染色工作液的配制

于實驗前，用37℃預熱的常用細胞培養基（比如：DMEM+10% FBS）將適量的250µM母液稀釋到250nM（1×）工作液，簡單渦旋或用槍吹勻后備用。染色工作液必須新鮮配制，久置后可能導致部分染料降解或沉淀。染色工作液不可重復使用。

3. 細胞準備和染色

j 按常規方法，在爬片上、玻底培養皿或玻底多孔板中接種和培養細胞。

k 當細胞生長到所需密度，用新鮮配制的染色工作液替換舊的培養基，確保染色工作液覆蓋所有的細胞。l 于37℃、5% CO2的培養箱中避光孵育15~30min。

m 用37℃預熱的培養基清洗細胞1~2次，之后更換成不含探針的培養基，即可用于熒光成像。

4. 細胞成像

PKMDR染色后的細胞最好用標準的Cy5濾片設置來進行成像。

染色示例（來自文獻，僅做參考）

文獻來源1)：Saimi, Dilizhatai, et al. "Imaging mitochondrial membrane potential via concentration-dependent fluorescence lifetime changes." Nature Communications 16.1 (2025): 11088.

實驗目的：活細胞FLIM成像的PKMDR標記

實驗方法：成像前一天接種細胞在玻底培養皿，密度約4×?104 個細胞/ml。細胞用含250nM PKMDR的DMEM培養基于37℃孵育20min。之后用預熱PBS清洗3次以去除未結合染料，然后加入不含染料的DMEM進行成像分析。如有必要，成像前再孵育15min能減少非特異性的ER標記。

Fig 1. a Time-lapse FLIM imaging of PKMDR-stained mitochondria in L929 cells. Images were acquired every 15?s. Spontaneous mitochondrial membrane potential change events were indicated with arrows. b Fluorescence lifetime profiles of the two ROI specified in (a). c Time-lapse FLIM imaging of mitochondria in a neuron. Images were acquired every 11?s. Two mitochondria underwent transportation are indicated with arrows. Scale bars, 20?μm.

文獻來源2)：Vringer, E., Heilig, R., Riley, J.S. et al. Mitochondrial outer membrane integrity regulates a ubiquitin-dependent and NF-κB-mediated inflammatory response. EMBO J 43, 2 (2024). 

實驗目的：活細胞成像和時差顯微鏡（TLM）檢測

實驗方法：細胞接種在μ-Slide載玻片培養腔室或35mm培養皿。細胞用DMSO或S6/ABT-737/Q-VD-Oph處理。MitoTracker Green (200?nM), PkMito DeepRed (1:2000)和Hoechst (1:2000)分別于成像前1h，30min和15min加入，并做清洗。

Fig 2.(A) Timelapse of U2OS cells expressing GFP-NEMO. Cells were treated with 10?μΜ ABT-737, 10?μΜ S63845 and 30?μΜ Q-VD-OPh. Mitochondria and nuclei are visualised using PkMito DeepRed and Hoechst, respectively. Cells were treated for 1?h with images taken every 10?min. Image is representative for three independent experiments. Scale bar is 20?μm.

參考文獻

[1]Yang, Zhongtian, et al. "Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging." Chemical science 11.32 (2020): 8506-8516.

[2]Saimi, Dilizhatai, et al. "Imaging mitochondrial membrane potential via concentration-dependent fluorescence lifetime changes." Nature Communications 16.1 (2025): 11088.

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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