aRhod-2, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級純

（長波長的可見光鈣離子探針）

重要提醒（購買或初次使用前）請務必查閱：

【務必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（MS4301-1G）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。

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搜索關鍵詞：

Rhod-2 AM Cell Permeant 鈣離子熒光探針；Rhod-4, AM；Fluo-8； Fluo-4； HTS Screen Assay 高通量篩選；

訂購信息：

產品描述

Rhod-2是一種高親和力的可見光激發波長Ca2+熒光探針。類似于Fluo-3或Fluo-4，其激發和發射光譜不會隨著Ca2+濃度變化發生明顯的遷移，熒光信號一旦與Ca2+結合后明顯增強。不同于Fluo-3或Fluo-4，Rhod-2的波長更長（Ex/Em=549/578 nm），這一特性使其更適合具高水平自熒光信號細胞或組織的Ca2+水平檢測，還可用來檢測由光感受器和籠鎖Ca2+螯合劑光激活導致的Ca2+釋放。

Rhod-2, AM是Rhod-2的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡單培養，即可輕易進入細胞。一旦進入細胞內，即被其內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-2，從而滯留在胞內以發揮相應生理功能。本品以凍干粉的形式提供，使用時只需經無水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的儲存液，并依據具體實驗和相關文獻資料調整到需要的工作濃度即可。

主要特征：

1）   長波長鈣離子探針，能夠與GFP和綠色熒光探針兼容；

2）   特別定位在線粒體。以羅丹明結構為基礎的Rhod-2 AM帶正電荷，以電位驅動的方式吸收聚集在線粒體，熒光顯微鏡下觀察加載進入細胞呈現點狀染色模式。有文獻認為，Rhod-2是線粒體Ca2+的選擇性探針，不過這一理論并未得到廣泛支持。

3）   檢測平臺：熒光成像，流式細胞術，酶標儀，高內涵篩選（HCS）

基本特性：

1）   CAS NO：145037-81-6

2）   化學名：9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2- oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium, monobromide

3）   同義名：Rhod-2, Acetoxymethyl Ester

4）   分子式：C52H59N4O19Br

5）   分子量：1123.96

6）   外觀：紅色固體

7）   最大激發/發射波長：549/578 nm

8）   Kd（Ca2+結合）：570NM

9）   溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

10）化學結構式：

保存與運輸方法

保存：-20℃干燥避光保存，至少一年有效。

運輸：室溫運輸。

注意事項

1）   熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）   Rhod-2從低濃度Ca2+到高濃度Ca2+的熒光增強程度低于Fluo-3，另外，Rhod-2的熒光信號弱于Fluo-3。

3）   乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

4）   Rhod-2, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

5）   Rhod-2, AM第一次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內使用。

6）   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據具體的實驗條件做出調整。

A， 試劑準備

1）  配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：MS4301-1G）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）  HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1）   用無水DMSO溶解Rhod-2, AM配制成2-5mM的儲存液，或將已配好的Rhod-2, AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Rhod-2, AM中加入11.1µl 無水DMSO）。準備Rhod-2, AM工作液之前，有時需要往Rhod-2, AM儲存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強AM探針的水溶性。

【注①】：Rhod-2, AM染色工作液制備前，添加等體積20% Pluronic F-127溶液到Rhod-2, AM+DMSO儲存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進入細胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

2）   用HHBS或其他生理緩沖液將 Rhod-2, AM+DMSO儲存液稀釋到1-10µM的工作液。

【注①】：Rhod-2,AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5µM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用zui低探針濃度。

【注②】：Rhod-2, AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3）  【可選】如果細胞內含有機陰離子轉運體，丙huang舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細胞培養基內，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙huang舒或磺吡酮儲存液相當偏堿，因此加入培養基后需要重新調整pH。

4） 將準備好的Rhod-2, AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。37℃孵育20min-2h。

【注①】：若使用含血清的培養基，血清內酯酶會降解AM，從而降低Rhod-2, AM加載效果。而含酚紅培養基會使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細胞清洗2~3次。

【注②】：關于孵育的時間，如果shou次做實驗不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會降低探針的區室化現象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如2.5mM丙huang舒的緩沖液）清洗細胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 室溫再孵育30min以保證細胞內AM的完quan去酯化。

7） 用適當的儀器如激光共聚焦、流式細胞儀、熒光酶標儀，以及波長Ex/Em=549/578 nm來進行檢測。

Rhod-2 AM的應用實例：

1）   應用目的：用Ca2+熒光探針Rhod-2 AM（MX4507-50UG）檢測順bo（cisplatin）敏感SKOV3細胞和順bo耐性SKOV3/DDP細胞內線粒體Ca2+水平的變化。

Fig 1. 順bo或ATP處理誘導SKOV3細胞線粒體Ca2+內流，并非SKOV3/DDP細胞。A）兩種細胞系分別用ATP誘導處理，時間序列掃描檢測線粒體Ca2+變化，通過共聚焦顯微鏡得到數據。B）細胞用6 μg/ml順bo處理0h，8h和16h后用共聚焦顯微鏡檢測（bar，20 μm）。

2）   應用目的：用Ca2+熒光探針Rhod-2 AM（MX4507-50UG）檢測順bo（cisplatin）對HeLa細胞線粒體Ca2+水平的變化。

Fig 2. 順bo增加細胞漿和線粒體內游離Ca2+水平。A）HeLa細胞用順bo（2.5, 5 or 10 µg/ml）處理0h，6h，12h和24h后，用熒光鈣離子探針Fluo-4 AM孵育。細胞漿Ca2+濃度用共聚焦顯微鏡觀察（bar，40 μm）。B）Fluo-4 AM定量檢測細胞漿內游離Ca2+水平。C）HeLa細胞用順bo（2.5, 5 or 10 µg/ml）處理0h，6h，12h和24h后，用熒光鈣離子探針Rhod-2 AM孵育。線粒體Ca2+濃度用共聚焦顯微鏡觀察（bar，40 μm）。D）Rhod-2 A定量檢測線粒體內游離Ca2+水平。

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——Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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